酶免疫技术在食品检测中的应用(三)
时间:2018-12-30 17:57:05 来源: 荣一娱乐 作者:匿名


第四,酶和底物

酶缀合物是酶和抗体或抗原的产物,半抗原在交联剂的作用下连接,并且是ELISA成功或失败的关键试剂。它不仅具有抗体特异性免疫应答,还具有酶促反应,显示出生物放大作用,但不同的酶使用不同的底物。最常用的酶是辣根过氧化物酶。辣根过氧化物酶的常见底物是OPD,但OPD具有致癌作用,显色不稳定。因此,近年来人们更愿意使用稳定和非致癌的效果。 TMB充当辣根过氧化物酶的底物。见表14-1。辣根过氧化物酶催化以下反应:

其中,AH2是无色底物,氢供体; A是彩色产品。

五,固相载体

在ELISA中有许多可用作载体的物质,聚苯乙烯是最常用的。聚苯乙烯具有很强的吸附蛋白质的能力,并且抗体或蛋白质抗原在被吸附后保留其原始的免疫活性。聚苯乙烯是塑料的,可以制成各种形状。它在ELISA测量过程中被广泛用作载体和容器,不参与化学反应,并且价格低廉。

ELISA载体有三种主要类型:小管,珠子和微孔板(板)。小试管的特征在于容器也可以作为反应,最后将比色计放入分光光度计中。珠子通常是直径为0.6cm的球体,并且在表面结霜后吸附面积增加。如果使用特殊的洗涤器,则在洗涤过程中滚动并冲洗球,效果更好。最常用的载体是微反应板。专用于EIJSA测量的产品也称为ELISA板。国际标准板形为8×12 96孔。为了便于检测少量样本,制作8或12个接合条,并且在放入支架后,其大小与标准ELISA板的大小相同。 EIJSA板的特点是能够同时检测大量样品并快速读取特定色度计的结果。如今,有多种用于ELISA检测微反应板类型的自动化仪器。装载,洗涤,保温和比色的步骤可以自动化,这对操作的标准化非常有利。

良好的EIJSA板应具有良好的吸附性能,低空白值,孔底部的高透明度,以及板与同一板中的孔之间的相似性能。由于成分和制造工艺的不同,聚苯乙烯ELJSA板的质量差异很大。因此,每批聚苯乙烯产品在使用前必须经过性能检查。常用的检测方法是:用一定浓度的人IgG(通常为10 ng/mL)涂上ELISA板的每个孔后,在每个孔中加入适当稀释的酶标抗人IgG抗体,保温后清洗,加入基材颜色。在酶反应终止后,测量每个孔溶液的吸光度。控制反应条件,使读数约为0.8。计算所有读数的平均值,所有单个读数与平均读数之间的差异应小于10%。类似于聚苯乙烯的塑料是聚氯乙烯。作为ELISA固相载体,聚氯乙烯片材的特征在于柔软性,薄度,切割性和低成本,但是整理剂不如聚苯乙烯那样好。聚苯乙烯对蛋白质的吸附性能高于聚苯乙烯,但空白值有时略高。除塑料产品外,还有两种用于固相酶免疫测定的材料。一种是微孔膜,例如硝酸纤维素膜,尼龙膜等。另一个载体由含铁磁性颗粒制成。固相颗粒在反应过程中悬浮在溶液中,并具有液相反应速率。反应结束后,吸引磁铁作为分离手段,洗涤也很方便,但需要配备。特殊仪器。

第六,选择最合适的工作浓度

在建立ELISA测定中,应选择包被的抗原或抗体的浓度和酶标记的抗原或抗体的浓度以实现最合适的测定条件并节省测定成本。下面以夹心法测定抗原为例,介绍最佳工作浓度的选择方法。

在夹心ELISA中,可以通过棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度,如下所示,参见表14-2。

(1)用包被缓冲液将抗体免疫球蛋白稀释至蛋白质浓度为10,1,0.1μg/mL,并涂布在ELISA板上,每个浓度包括三个纵行,并完成包被。洗涤。

(2)向每个横向涂覆的孔中添加强阳性抗原溶液,向阴性对照溶液中加入另一个弱阳性抗原溶液和第三水平线,加热和洗涤。

(3)将酶标记的抗体用稀释剂稀释至三种浓度,例如10×177×1000,10×177b 5000和10×177b 25000.将每种包装加入各浓度的华尔特中,并保温和洗涤。

(4)添加基材颜色。通过酸添加终止反应后,读取A值。

(5)强阳性抗原的A值的最佳浓度为约0.8,阴性参照的A值小于0.1,并相应地选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度。从表14-2可以看出,涂层抗体浓度可以选择为1μg/mL,酶标记抗体的稀释度可以选择为1: 5000.为了进一步保存试剂,浓度可以用作基点,并且可以减小间距以进一步检查滴定。

参考:现代食品检测技术

相关链接:

酶免疫测定在食品检测中的应用(1)

酶免疫测定在食品检测中的应用(2)

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